Ingeniería celular mediante reprogramación de circuitos de regulación génica

Luis Fernando Covarrubias Robles, Concepción Valencia García, Sinaid Martínez Pérez, Lían Mishel Sánchez Cázares y Celina García Meléndrez

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Nuestro enfoque de investigación ronda sobre las causas, componentes y mecanismos por los que las células indiferenciadas 'deciden' tomar una u otra ruta de diferenciación que las hace adquirir aspecto (identidad) y funciones características. Para abordar este y varios procesos conexos —desarrollo embrionario, regeneración, clonación, cáncer— es preciso auxiliarse de otras disciplinas y enfoques experimentales, así como de unas cuantas metáforas que ayudan a entender el significado de un amplio catálogo de nombres técnicos y transformaciones.

Programación y reprogramación

Es común escuchar el término "programación" al referimos a dispositivos electrónicos, particularmente las computadoras. En este contexto, la programación habla de una serie de instrucciones (i.e., algoritmos) ingresadas a una máquina para que ejecute una serie de operaciones específicas que visualizamos de algún modo cuando 'corre' el programa. Sin entrar en detalles de cómo fluyen tales instrucciones, queda claro que especifican entradas (input) que, en el curso del tiempo, dibujan caminos que dirigen a 'salidas' (output) definidas por los algoritmos y plasmadas en un código o lenguaje (el software) que el aparato (el hardware) sabe "entender".

Lo normal es que haya un estado inicial, que paulatinamente va cambiando hasta alcanzar un resultado final. Una reprogramación implica cambios que dibujan caminos alternos para dar un resultado distinto.

¿Qué son los circuitos de regulación génica para la programación celular?

En las células los algoritmos, con las instrucciones necesarias para que un tipo celular específico diferenciado (resultado final) surja a partir de un tipo celular indiferenciado (estado inicial), se ejecutan mediante el "prendido" (activación) y "apagado" (represión) de la expresión de múltiples genes —cuyos ARNs o proteínas que codifican pueden o no aparecer, respectivamente— que establecen una dinámica reproducible en forma de "redes" o "circuitos" de regulación génica. Como en los programas de computadora, la ejecución de los algoritmos celulares (el software) no está determinado por el genoma (el conjunto de genes; el hardware), sino que progresa con la influencia determinante de factores externos (contacto con otras células, hormonas, iones), e internos (moléculas citoplasmáticas), que actúan en cada célula a lo largo del proceso de diferenciación para concluir en circuitos de regulación génica específicos y estables.

Al final del proceso de especificación celular —que le dará identidad a la célula— los circuitos de regulación génica se traducen en que ciertos genes quedan prendidos y otros quedan apagados y, a su vez, en un conjunto de proteínas cuya actividad, abundancia, localización e interacción, entre ellas o con los propios genes, les dan características estructurales y funcionales a las células especializadas. Este patrón se genera paulatinamente, recorriendo estados transitorios, desde una célula indiferenciada (troncal) hasta convertirse en una célula diferenciada (especializada) y, en términos generales, tener un 'nombre' que le asignan l@s investigadores en citología de acuerdo con sus características distintivas.

 

Las células troncales generan tipos celulares diferenciados

Cada célula de nuestro organismo que forma parte de los tejidos y los órganos tienen una "historia" que la biología del desarrollo estudia —a distintos niveles y con diversos modelos experimentales— buscando los factores, los modos y los momentos que la explican, desde las etapas tempranas hasta la madurez. En etapas iniciales del desarrollo de los mamíferos, se genera en el embrión una estructura conocida como "masa celular interna", compuesta fundamentalmente por células troncales capaces de dividirse indefinidamente y con capacidad de diferenciarse, dando origen a los diversos tipos celulares que componen al organismo adulto, incluyendo las células germinales (de donde derivan los gametos, óvulos y espermatozoides). En esta etapa del desarrollo, dada su amplia capacidad de diferenciación, estas células troncales reciben el nombre de "células troncales pluripotentes" y, a los derivados de ellas que se pueden mantener en un sistema de cultivo in vitro, se les denomina células troncales "embriónicas" (ESC, por las siglas en inglés Embryonic Stem Cells) [Fig. 1].

 

 

Como resultado de la interacción entre diversas proteínas, incluyendo aquellas que activan o reprimen la expresión génica, en las ESC se establece la "red de regulación génica de pluripotencia" (red RGP), responsable de que estas células mantengan un estado funcional con un alto potencial de diferenciación. Esta red de regulación génica de las ESC sirve de punto de partida para dar lugar a los diversos tipos celulares especializados, como las neuronas (sistema nervioso), adipocitos (tejido graso) o hepatocitos (células del hígado), cada uno con su red de regulación génica específica, diferentes a la RGP. En los procesos de conversión de una célula indiferenciada a una célula terminalmente diferenciada, la RGP transita por nuevas redes de regulación génica (transitorias, inestables y estables) que son determinadas por algoritmos que, más que estar programados, "evolucionan" conforme la diferenciación progresa —como ya se dijo— bajo la influencia de factores externos e internos (definidos por la posición y vías de señalización).

¿Son reversibles los procesos de diferenciación?

Durante mucho tiempo, se consideró que la red de regulación génica específica para cada tipo celular era muy estable y difícilmente se podría revertir o alterar. Sin embargo, en 1996, cuando se logró la clonación de la oveja Dolly mediante la transferencia del núcleo de una célula diferenciada a un ovocito al que previamente se le retiró su núcleo, se hizo evidente que, bajo ciertas condiciones, la red de regulación génica específica de un núcleo "maduro" podía modificarse bajo otro contexto celular, de modo que puede reiniciar el desarrollo organizado de todos los tipos celulares. También fue sorprendente que, en 2006, un grupo de investigadores japoneses lograra (re)establecer la red RGP característica de las ESC introduciendo en células diferenciadas (fibro-blastos de embrión de ratón) un pequeño número de genes. Ya se conocía que estos genes (referidos como Oct4, Sox2, Klf4, Myc; [1]) son normalmente muy activos en células tipo ESC, pero lo que el experimento mostró fue que esos 4 genes son suficientes para modificar la red regulatoria de la célula diferenciada y reprogramar a las células hasta presentar los circuitos característicos de pluripotencia, similares a los de las ESC; entonces, a estas células reprogramadas se les denominó "células troncales pluripotentes inducidas" o iPSC (por las siglas en inglés induced Pluripotent Stem Cells) y consecuentemente, a este proceso de conversión, reprogramación celular [Fig. 2].

 

 

Tal intervención provoca una desdiferenciación, aunque las etapas o instrucciones no son exactamente un proceso inverso de la diferenciación. A la fecha, diferentes grupos de investigación del mundo —incluido el nuestro— han logrado implementar la reprogramación celular a pluripotencia de diversos tipos celulares especializados, incluyendo células de origen humano.

Nuestras contribuciones en investigación sobre la red RGP

En nuestro Laboratorio sobre Plasticidad Celular del IBt-UNAM, hemos logrado reprogramar dos tipos de células diferenciadas (fibroblastos y astrocitos aislados de embriones de ratón), introduciendo el mismo grupo de genes utilizado por los autores japoneses [1], aunque establecimos una metodología diferente. En resumen, utilizamos un transposón, que es un fragmento particular de ADN capaz de integrarse eficientemente en genomas con ayuda de la enzima transposasa. En nuestro caso, a este elemento genético le añadimos los 4 "genes de reprogramación" MKOS (por las siglas de Myc, Klf4, Oct4 y Sox2) y también, otro gen que codifica para una proteína fluorescente (llamada 'Venus'; [2]) que nos sirve como marcador visual al microscopio [Fig. 3]. Utilizando el fármaco doxiciclina como inductor de la expresión de los genes MKOS clonados en este transposón, nosotros detectamos (en comparación a otros experimentos similares), niveles más elevados de expresión de los genes de reprogramación celular, debido a que incorporamos un "circuito de retroalimentación positiva" con los genes del transposón (a mayor inducción, mayor expresión), que resultó ser más eficiente, dando lugar a un mayor número de colonias iPSC en menor tiempo.

 

 

Para entenderlo mejor, en la Figura 3 mostramos como se observa el proceso de reprogramación celular a través de un microscopio utilizando nuestro sistema experimental, al que hemos denominado "Booster". Durante los 2 primeros días en cultivo, podemos observar grupos de fibroblastos que han incorporado los 4 genes del complejo MKOS, como lo indica la fluorescencia verde proveniente de la proteína Venus. Conforme pasan los días, se puede apreciar la transformación de estos grupos de células hasta que paulatinamente forman arreglos compactos —característico de las ESC o iPSC crecidos en una placa de cultivo [3].

Actualmente, nos ha llamado la atención que la reprogramación celular inducida por los genes MKOS sólo puede ocurrir cuando las células están dividiéndose (en proliferación); con nuestro sistema Booster, por supuesto, este requerimiento también es palpable. La condición celular proliferativa puede ser la clave para entender cómo cambia la actividad del genoma, durante la programación normal que ocurre en el embrión en desarrollo o durante la reprogramación inducida. También tiene implicaciones en cuanto a cómo una célula normal se convierte en una célula cancerosa, proceso que comúnmente se inicia a partir de células en proliferación —tal como las que contribuyen a la renovación de las células de la piel, del intestino o del hígado. Es más, el incremento en la capacidad de regeneración de animales transgénicos a los que hemos introducido los oncogenes del papilomavirus humano (HPV) causante del cáncer cervicouterino pudiera relacionarse a modificaciones en la plasticidad celular [4]. Con base en este último hecho estamos investigando la reprogramación celular utilizando estos oncogenes, tanto de células que se encuentran en división como de aquellas que han dejado de proliferar como consecuencia de su diferenciación. Los resultados de estos experimentos brindarán un mejor entendimiento de los factores que restringen la plasticidad celular y su relación con la susceptibilidad a desarrollar cáncer.

Conclusión

La reprogramación celular es una muestra del grado de plasticidad del genoma —en el sentido de la facilidad para prender y apagar genes— y que supone un proceso de reestructuración de las redes y circuitos de regulación génica. En un organismo adulto, incrementar la plasticidad celular puede percibirse como favorable, considerando los procesos de diferenciación celular necesarios para la renovación o regeneración de un tejido u órgano, pero desfavorable cuando la consecuencia es el inicio de procesos cancerosos. Por lo que, entender cómo evoluciona la "reconstrucción" de circuitos de regulación génica durante la reprogramación celular resulta relevante, y ayudará a elucidar cuáles son las "instrucciones" alternas o las condiciones que las provocan para producir tipos celulares específicos normales, o aquellos que originan el cáncer. Pues bien, estos son temas que motivan todos los días nuestro trabajo en el laboratorio.

Referencias y lecturas recomendadas

1. Takahashi K, Yamanaka S (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676.

2. Covarrubias L, Martínez-Sarmiento JA, Valencia C, Nagy A, & Hernández-García D. (2021). The levels of reprogramming factors influence the induction and maintenance of pluripotency: the case of CD1 mouse strain cells. Internat J Develop Biol 65(4-6): 365-376.

3. Sánchez-Cázares, LM (2020). Contribución de los oncogenes E6 y E7 a la reprogramación inducida por MKOS de células posmitóticas (Tesis de Maestría en Ciencias). IBt-UNAM.

4. García C, Hernández-Garcia D, Valencia C, Rojo-León V, Pérez-Estrada JR, Werner M & Covarrubias L (2017). E6/E7 oncogenes in epithelial suprabasal layers and estradiol promote cervical growth and ear regeneration Oncogenesis. 6(8): e374.

5. Covarrubias L, Castro-Obregón S (2008). "Degeneración y regeneración tisular: de la embriogénesis a la medicina regenerativa". pp. 145-158 En: "Una ventana al quehacer científico" (Cap. 13). Instituto de Biotecnología-UNAM / 25 aniversario, México, D.F.

6. Rojo-León V, García-Meléndrez C, Covarrubias-Robles L (2019). Bioluminiscencia: Herramienta para el estudio del cáncer y la regeneración celular. Biotecnología en Movimiento (Revista de divulgación del Instituto de Biotecnología de la UNAM), Núm. 16, pp.7-9.

    

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